Düşük fertilizasyona neden olan sperm örneklerinde fosfolipaz C zeta’nın immunfloresan gösterimi ve Plcζ gen mutasyonlarının tayini

Abstract

Erkek infertilitesi ve sebebi bilinmeyen infertilite, infertilite olguları arasında en sık görülenleridir. Mikroenjeksiyon yöntemi ile erkek infertilitesinin çözümünde çok önemli bir yol katedilmiş olsa da mikroenjeksiyon sonrası görülen fertilizasyon problemleri üzerinde hala yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Mikroenjeksiyon sonrası fertilizasyonun olmayışı büyük ölçüde sperm hücresinin oosit aktivasyonunu sağlayamamasına bağlanmaktadır. Fosfolipaz C Zeta (PLCζ); ayırt edici özellikleriyle sperm hücresi kaynaklı bir fosfolipaz olan çözünür 'sperm hücresi faktörü'dür ve oosit aktivasyonunu sağlayan en önemli faktörlerdendir. Fertilizasyon esnasında; sperm hücresi, oosit aktivasyonu için gerekli olan sürekli ve tekrarlayan intrasellüler serbest kalsiyum (Ca+2) salınımını tetikler. Sperm hücresi ekstraktlarındaki Fosfolipaz C Zeta eksikliği ise kalsiyum salınım yeteneğini inhibe eder. Oosit aktivasyon bozuklukları (OAD), Fosfolipaz C Zeta’nın anormal ekspresyonu, lokalizasyonu ve protein yapısına bağlanmıştır. Çalışmamızda; düşük fertilizasyona neden olan sperm örneklerini (globozoospermik, total fertilizasyon başarısızlığı (TFF), nükleer anomali, total immotil) normospermik örneklerle karşılaştırarak, Fosfolipaz C Zeta molekülünün lokalizasyonunu immunfloresan yöntemiyle belirlemeyi ve bu olgularda deoksiribonükleik asit (DNA) dizi analizi yöntemiyle bilinen mutasyonların Fosfolipaz C Zeta‘nın 15 ekzonunda taranmasını ve yeni mutasyon ve polimorfizmlerin belirlenmesini amaçladık. Bu çalışma sonucunda düşük fertilizasyon gösteren sperm örneklerinde Fosfolipaz C Zeta lokalizasyonu normospermi grubuna göre baş ve post-akrozomal bölgelerde azaldığı ya da hiç olmadığı belirlendi. DNA dizi analizi ile düşük fertilizasyona neden olan sperm örneklerinde pek çok değişim saptandı. Literatürde hiç yer almamış ve protein farklılaşmasına neden olan bazı değişikliklerin yanı sıra stop kodonuna dönüşen bir nükleotid değişimi de saptandı. Sonuç olarak, Fosfolipaz C Zeta molekülünün düşük fertilizasyon gösteren bireylerdeki fertilizasyonda oosit aktivasyonunda etkili rolünün olduğu ortaya koyulmaktadır.

Immunoflourescence Determination and Mutation Analysis of Phospholipase C Zeta In The Sperm Specimen Give Rise to Low Fertilization Male and unexplained infertility are the frequent cases among the infertile patients. Although the solution of male infertility have been solved by microinjection, extensive studies about fertility problems after microinjection are still performing. Fertilization failure after microinjection is highly related with sperm cells which unable to provide oocyte activation. Phospholipase C Zeta (PLCζ) is a soluable sperm factor with it’s unique features and one of the most important oocyte activating factor. Upon fertilization, the sperm triggers repetitive and persistent changes in the intracellular concentration of free calcium, also referred to as oscillations, that are required for egg activation. PLCζ deficiency in the sperm extracts inhibits the ability of calcium oscillation. Oocyte activation deficiencies was interested with abnormal protein structure, expression, and localization of the PLCζ. In our study we aimed the determination of immunoflourescence PLCζ in the sperm specimens that give rise to low fertility rate (globozoospermia, total fertilization failure, nuclear anomaly, total immotile) by comparing with normospermic specimens and determination of the novel mutations and polymorphisms and also screening of the known mutations at 15 exons via DNA sequencing. As a result of this study, the localization of PLCζ in the sperm specimens that give rise to low fertility rate compared with normospermic specimens was determined decrease or absence in the head and post-acrosomal region. Many variations were detected in sperm specimens that give rise to fertility with the anaylsis of deoxyribonucleic acid (DNA) sequencing. As well as some variations which didn’t never take place in literature, and caused protein differentiation, a nucleotide variation, which turned into the stop codon, was determined. In conclusion, it was proved that PLCζ has a significant role of oocyte activation in whom has shown low fertility individuals.