Fitohemaglutinin ve İnterlökin-2’nin İnsan-T-Hücrelerine Etkisinin Karşılaştırılması

Abstract

Amaç: Bu çalışmada, CD3+T-hücrelerini fitohemaglutinin (phytohemagglutinin,PHA), İnterlökin-2(interleukin-2,IL-2) ve PHA+IL-2 ile birlikte uyararak, farklı uyarıcılarla uyarılmanın CD3+T-hücre çoğalım ve aktivasyon molekülleri ekspresyonuna etkisinin belirlenmesi amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Sağlıklı 15 kadının herbirinden 6 mL periferik kan örneği alınarak RosetteSep yöntemiyle 3x106 adet CD3+T-hücre izole edildi. CD3+T-hücreleri faz-kontrast mikroskopta sayıldı ve izolasyon saflıkları immunfloresan ve akım sitometrik yöntemlerle belirlendi. 12 kuyucuklu kültür kabının 3’er kuyucuğuna 2x105 adet paylaştırılan hücrelere 10 ?g/mL PHA, 13?L/mL IL-2 ve 10 ?g/mL PHA+13?L/mL IL-2 uygulanarak 24 saat inkübatörde inkübe edildi. Uyarıcıyla uyarılmamış CD3+T-hücreleriyle (kontrol grubu) karşılaştırılan uyarılmış CD3+T–hücre gruplarının; çoğalımları spektrofotometrik yöntemle WST-1 testi ve akım sitometride CFSE testi ile aktivasyon moleküllerinin ekspresyonları CD25,CD38,CD69,CD71 ve HLA-DR antikorları ile akım sitometride ölçüldü. Bulgular: WST-1 ve CFSE test değerleri gruplar arasında istatistiksel olarak karşılaştırıldığında; PHA-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) ve PHA+IL- 2-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) IL-2-CD3+T-hücrelerinden anlamlı olarak daha fazla çoğaldıkları yani uyarıldıkları tespit edildi. Akım sitometride ölçülen aktivasyon moleküllerinin düzeyleri gruplar arasında istatistiksel olarak karşılaştırıldığında; IL-2-CD3+T-hücrelerine kıyasla, PHA-CD3+Thücrelerinde ve PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinde CD25 (p <0.001), CD38 (p <0.001), CD71 (p <0.001) ve HLA-DR (p <0.001) % ekspresyon düzeylerinde anlamlı artış tespit edildi. Sonuç: PHA ve PHA+IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinde hücre proliferasyonunun ve aktivasyon molekülleri düzeylerdinin benzer olduğu ve IL-2 ile uyarılan hücrelere kıyasla fazla olduğu tespit edildiğinden, invitro çalışmalarda CD3+T-hücre uyarıcısı olarak PHA kullanılmasının başka bir uyarıcıya gerek duyulmaksızın tek başına etkin olduğu ve CD3+T-hücrelerde IL-2’ye kıyasla daha fazla çoğalımı ve uyarılmayı sağladığı sonucuna varıldı.

Objective: In this study, it is aimed to determine the effect of stimulation with different stimuli on CD3+T-cells proliferation and activation molecules by stimulating phytohemagglutinin (PHA), Interleukin-2 (IL-2) and PHA+IL-2 together. Material and Method: Six mL peripheral blood samples were obtained from each 15 healthy women and their 3x106 CD3+T-cells were isolated by the RosetteSep method. CD3+T-cells were counted on a phase-contrast microscope and their isolation purity were determined by immunofluorescence and flow cytometric methods. 2x105 cells were apportioned in a 3-well dish of a 12-well culture dish, applied 10?g/mL PHA, 13?L/mL IL-2 and 10?g/mL PHA+13 ?L/mL IL-2 and incubated in incubator for 24 hours. Cells groups of stimulated CD3+T-cells compared with CD3+T-cells(control group) not stimulated with any stimulants; their proliferations measured by spectrophotometric method using WST-1 test and flow cytometry by CFSE test, their expressions of activation molecules measured by flow cytometry with CD25, CD38, CD69, CD71 and HLA-DR antibodies. Results: When WST-1 and CFSE test values were compared statistically between groups; It was determined that PHA-CD3+T-cells (p <0.001) and PHA + IL-2-CD3+T-cells (p <0.001) were significantly more proliferated, in other words activated than IL-2-CD3+T-cells. When levels of activation molecules evaluated by flow cytometry were compared statistically between groups; in comparison to IL-2-CD3+T-cells, significantly increased % expression values of CD25 (p <0.001), CD38 (p <0.001), CD71 (p <0.001) and HLA-DR (p <0.001) were detected in PHA-CD3+T-cells and PHA+IL-2-CD3+T-cells. Conclusion: Since the proliferation and activation molecule levels in CD3+T-cells stimulated by PHA and PHA + IL-2 were similar and more than than stimulated by IL-2, it was concluded that the use of PHA as a CD3+T-cell stimulant in invitro studies alone was effective with no need for other stimulants and provided more proliferation and stimulation compared to IL-2 in CD3+T-cells.