Jasplakinolid ile F-aktin Stabilizasyonu Uygulanan Endotel Hücrelerinde Difteri Toksini Trafiği

Abstract

Amaç: Ökaryotik hücrelerde mikrofilament yapısının ana bileşeni olan aktin, sinyal yolaklarını aktin bağlayan proteinlerle etkileşerek düzenler. Daha önceki çalışmalarımızda difteri toksini ve mutant difteri toksini (CRM-197) ile enfekte olan endotel hücrelerinde toksinin A fragmenti ile etkileşen filamentöz aktinin depolimerleştiği saptanmıştır. Bu çalışmada endotel hücrelerinde F-aktin stabilizasyonu sağlanarak difteri toksininin hücre içi trafiğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Hücre kültüründe endotel hücreleri çoğaltıldı ve jasplakinolid (0.1 µmol/ml) ile sırası ile 30 ve 60 dakika uygulandı. Diferi toksini (0.75 nmol/ml) uygulaması için jasplakinolid ile inkübasyon süresi 15 dakika ile sınırlandırıldı. Hücre içi F-aktin stabilizasyonu ve difteri toksini trafiği immünofloresan mikroskopisi ile görüntülendi. Bulgular: Bekletme süresine bağlı olarak stres liflerinin jasplakinolid uygulanan endotel hücrelerinin hücre zarında belirginleştiği belirlendi. F-aktin stabilizasyonu sağlanan endotel hücrelerinde difteri toksini trafiğinin engellenmediği ve A fragmenti’nin perinükleer alana yöneldiği görüntülendi. Sonuç: Hücre içinde F-aktin stabilizasyonu ile G-aktin/F-aktin dönüşümünün engellenmesi difteri toksini trafiğini durdurmamaktadır. Bu sonuç toksin trafiğinde filamentöz aktinin önemini gösteren çalışmaları desteklemektedir.

Objective: Actin, the main component of microfilament structure in eukaryotic cells, regulates signaling pathways by interacting with actin binding proteins. Our previous studies have shown that depolymerization of filamentous actin (F-actin) occurs following its interaction with fragment A of the toxin in endothelial cells infected with diphtheria toxin and mutant diphtheria toxin (CRM-197) . In this study, it was aimed to determine intracellular trafficking of diphtheria toxin by stabilization of F-actin in endothelial cells. Material and Methods: Human umbilical vein endothelial cells were cultured and incubated with 0.1 ?M jasplakinolide for 30 and 60 minutes respectively. For diphtheria toxin (0.75 nM) treatment, the incubation period with jasplakinolide was limited to 15 minutes. Intracellular stabilization of F-actin and diphtheria toxin traffic were visualized using immunofluorescence microscopy. Results: Depending on the duration of the incubation period, it was determined that the stress fibers were expressed in the cell membrane of the endothelial cells treated with jasplakinolide. It was shown that diphtheria toxin trafficking was not inhibited in F-actin-stabilized endothelial cells and fragment A was directed to the perinuclear area. Conclusion: Inhibition of G-actin / F-actin turnover in steady state by intracellular F-actin stabilization does not stop diphtheria toxin trafficking. This result supports studies showing the importance of filamentous actin in toxin trafficking.