Candida albicans suşlarının genotiplendirmesinde 25S intron analizini takiben restriksiyon enzim analizi uygulanması

Abstract

Candida albicans, özellikle bağışıklığı baskılanmış konaklarda enfeksiyon etkeni olarak en sık izole edilen fungal patojendir. Uygun enfeksiyon kontrol stratejilerinin geliştirilmesi ve epidemiyolojik veri toplanması açısından, enfeksiyon etkeni olan mikroorganizmaların genotiplendirilmesi önem taşımaktadır. 25S intron analizi, C.albicans suşlarının genotiplendirilmesinde kullanılan kolay ve güvenilir bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, ayırım gücünün düşük olması, epidemiyolojik araştırmalarda bu yöntemin kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu çalışmada, enfeksiyon etkeni olarak izole edilen C.albicans suşlarının polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile 25S intron analizini takiben, elde edilen PCR ürünlerinin restriksiyon enzim analizine tabi tutulmasıyla ayırım gücü daha yüksek olan bir genotiplendirme sistemi oluşturulması amaçlanmıştır. Bu çalışmaya, çeşitli klinik örneklerden (121 kan, 69 balgam, 36 vajinal akıntı, 26 yara, 8 idrar) enfeksiyon etkeni olarak izole edilmiş 260 adet C.albicans suşu dahil edilmiştir. Tüm izolatlara, PCR ile literatürde belirtildiği şekilde 25S intron analizi uygulanmış ve elde edilen PCR ürünleri HaeIII restriksiyon enzimi ile kesilerek genotiplendirilmiştir. Her iki yöntemin ayırım gücü ayrı ayrı hesaplanmıştır. 25S intron analizi ile 184 (%70.8) izolat genotip A, 42 (%16.2) izolat genotip B ve 34 (%1 izolat da genotip C olarak bulunmuş; yöntemin ayırım gücü 0.46 olarak hesaplanmıştır. PCR ürünlerinin HaeIII ile kesimi sonucunda genotip A’da 10, genotip B’de bir ve genotip C’de beş ayrı kesim paterni (genotip) tespit edilmiş; böylece restriksiyon enzim analizi eklenmesiyle elde edilen genotip sayısı 16’ya, yöntemin ayırım gücü de 0.79’a yükselmiştir. Farklı genotiplendirme yöntemlerinin birlikte kullanımı, genotip sayısını artırarak ayırım gücünü yükseltmekle birlikte, aynı suşların farklı genotiplere dağılmasıyla sonuçlanabilmekte ve bu durum değerlendirmede güçlüklere neden olabilmektedir. 25S intron analizini takiben HaeIII restriksiyon enzim analizi uygulanması ise, tamamen farklı bir genotiplendirme yöntemi eklenmesine gerek kalmaksızın yöntemin ayırım gücünü yükseltmekte ve yöntemi epidemiyolojik araştırmalar ve klinik izolatların genotiplendirilmesi için daha uygun hale getirmektedir. HaeIII yerine başka enzimlerin kullanılması yöntemin ayırım gücünü daha da yükseltebilir. Bu yöntemle elde edilen genotiplerle hasta özellikleri, klinik veriler, antifungal duyarlılıklar gibi parametreler arasında ilişki olup olmadığını araştırmak için daha detaylı araştırmalar planlanabilir.

Candida albicans is the most frequently encountered fungal pathogen especially in the immunocompromised hosts. Genotyping clinical microbial isolates is important for obtaining epidemiological data and for establishing appropriate infection control strategies in the hospital setting. 25S intron analysis is an easy and reliable method used for genotyping C.albicans strains. As it has a low discriminatory power, its use is limited in epidemiological studies. In this study, our aim was to genotype clinical C.albicans isolates by using 25S intron analysis followed by restriction enzyme digestion in order to develop a more discriminative genotyping system for C.albicans . A total of 260 clinical C.albicans strains isolated from various infection sites (121 blood, 69 sputum, 36 vaginal discharge, 26 wound, 8 urine samples) were genotyped by 25S intron analysis, and all the products obtained by polymerase chain reaction (PCR) were digested with HaeIII restriction enzyme. Discriminatory power of each method was calcula- ted. Among the isolates 184 (70.8%) were classified as genotype A, 42 (16.2%) as genotype B, and 34 (13%) as genotype C by 25S intron analysis. Discriminatory power of the method was calculated as 0.46. HaeIII restriction of genotype A, B and C isolates produced ten, one, and five restriction patterns (genotypes), respectively. By the addition of restriction enzyme analysis, the number of genotypes obtained was increased to 16, and the discriminatory power of the method to 0.79. Combining different genotyping methods increases the discriminatory power by increasing the number of genotypes obtained. However, there is also a risk to split certain strains in different genotypes by the different methods used and this makes the genotypic evaluation more difficult. On the other hand, combining 25S intron analysis with restriction enzyme analysis increases the discriminatory power without introducing a totally different method, and makes the method more suitable for epidemiological purposes and for genotyping clinical isolates. Different enzymes instead of HaeIII should be tested to evaluate the effect on the discriminatory power. In order to evaluate the relationship between the genotypes obtained by this method and parameters such as patient characteristics, clinical data, and antifungal susceptibilities, more sophisticated studies can be performed.